Après l'“Accademia di Arte Drammatica” et quelques spectacles de théâtre, Margherita débute au cinéma en 1986 avec La seconda notte de Nino Bizzarri. Cinq ans plus tard, elle reçoit le “Nastro d'Argento” de la meilleure actrice et le “David di Donatello” pour Le chef de gare de Sergio Rubini.
Elle travaille avec certains des plus grands réalisateurs italiens, de Daniele Luchetti à Carlo Verdone, de Mario Monicelli à Cristina Comencini et Paolo Virzì. En 1999, elle remporte un second David di Donatello avec Hors du monde de Giuseppe Piccioni ; un autre “Nastro d’Argento” lui est décerné pour son rôle dans Tableau de famille de Ferzan Ozpetek.
Le succès constant de Margherita Buy est confirmé en 2005 par Leçons d'amour à l'italienne de Giovanni Veronesi et I giorni dell’abbandono de Roberto Faenza. Autant à l'aise dans la comédie que dans des rôles dramatiques, l’actrice interprète en 2006 Le Caïman de Nanni Moretti, L'Inconnue de Giuseppe Tornatore et Commediasexi d'Alessandro D’Alatri.
Ses apparitions télévisuelles sont également de très grande qualité : on la retrouve, entre autres, dans Incompreso sous la direction de Enrico Oldoini et Le commissaire Maigret de Renato De Maria. En 2006, elle retourne au théâtre, sur scène dans Due partite (Jeux doubles) de Cristina Comencini.